三個(gè)保護(hù)步驟教你如何延長(zhǎng)色譜柱壽命

讓你的柱子永遠(yuǎn)不壞？

沒(méi)那么夸張，但是可以使柱子不那么快就壞。

有時(shí)候你會(huì)發(fā)現(xiàn)好像你用了大部分的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)在不停的買液相色譜柱。為什么色譜廠家不能把柱子的壽命延長(zhǎng)一些呢？實(shí)際上，在合理的維護(hù)下，柱子可以成為液相分析花費(fèi)里面很小的一部分。舉一個(gè)例子，一根典型的反相柱子的花銷在3405-4087元之間， 如果它能進(jìn)樣500-1000次，那么每一次進(jìn)樣的花費(fèi)是3.4-6.8塊錢。

盡管費(fèi)用會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)室和特定方法不同而變化，完成一次常規(guī)的進(jìn)樣分析，340塊錢的總費(fèi)用是合理的，這也可由做委托檢測(cè)業(yè)務(wù)的第三方實(shí)驗(yàn)室對(duì)類似分析的定價(jià)所確認(rèn)。

因此，我們上面談到色譜柱的花費(fèi)在總分析成本中只占1-2%，我們想方設(shè)法使柱子的壽命延長(zhǎng)一倍，即使單根柱子的成本還是很高，實(shí)際上這樣做并不能在整個(gè)分析成本上降低很多。我自己個(gè)人的感覺(jué)是如果你用一根柱子進(jìn)了500針，那這樣就已經(jīng)很劃算了。

什么是合理的期望值？

首先，先看一下其他幾個(gè)色譜學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)。 Ron Majors，在他的“色譜柱觀察”專欄的某期連載文章中，已經(jīng)包含了針對(duì)色譜各個(gè)方面的用戶調(diào)查結(jié)果。他有關(guān)色譜柱壽命的大部分專欄文章是在2012年發(fā)表的，將作為我們目前討論的基礎(chǔ)。圖1是基于Ron Majors 2011年用戶調(diào)查數(shù)據(jù)的餅型圖。

可以看到有回應(yīng)的調(diào)查對(duì)象中接近四分之三的進(jìn)樣壽命在500針以上，而且有近二分之一達(dá)到了至少 1000次的進(jìn)樣壽命。這個(gè)結(jié)果對(duì)我來(lái)說(shuō)是非常吃驚的，因?yàn)樗藢?duì)所有類型的色譜柱的壽命調(diào)查，不僅僅是現(xiàn)代液相中的*吃苦耐勞的用得*多的主力色譜柱，4.6×150mm，5μm反相柱，相對(duì)于其它種類色譜柱，它甚至有點(diǎn)刀槍不入的味道。

圖1 分析柱的典型進(jìn)樣次數(shù)。數(shù)據(jù)基于2011 年調(diào)查

為了看清隨著時(shí)間變化情況改變的情形，我做了一個(gè)1997年到2011年四個(gè)調(diào)查結(jié)果的比較圖，見圖2?？梢钥吹接袔讉€(gè)明顯的趨勢(shì)。

**，我注意到灰柱，灰柱代表的是在柱子損壞之前進(jìn)樣小于1000次的百分比，從1997年的76%跌倒了2011年的53%；同時(shí)有明顯對(duì)比的是代表能進(jìn)樣1000以上的黃柱高度增加很快。在上面我有提到我把進(jìn)樣500次作為柱子使用壽命的一個(gè)平衡點(diǎn)，我們可以發(fā)現(xiàn)在柱子壞之前進(jìn)樣次數(shù)達(dá)不到500次的用戶的數(shù)量明顯下降，從1997年的接近一半到2011的四分之一。

圖2 在LC柱子損壞之前進(jìn)樣次數(shù)的比較

*后我們可看到，有著可怕經(jīng)歷的用戶的數(shù)量，即那些只能做到100或者更少的進(jìn)樣次數(shù)的用戶，比例基本上沒(méi)有改變，徘徊在10%附近。

找出這種改變的原因只能是出于推測(cè)，但是我很樂(lè)意做此推斷。我不認(rèn)為柱子壽命有明顯的提升是因?yàn)橹庸に嚨母倪M(jìn)。

不可否認(rèn)，在某個(gè)時(shí)期，柱子塌陷，或者是柱床中有空腔形成的情況非常普遍，但是在1997年開展調(diào)查的時(shí)間段，裝柱工藝就已經(jīng)非常成熟了，由于裝柱工藝導(dǎo)致柱子損壞的情況很少見。我認(rèn)為柱子壽命延長(zhǎng)的主要原因是用戶受到更好的培訓(xùn)，從而對(duì)樣品前處理和柱子的物理保護(hù)更好了。

柱子的保護(hù)方法就是我想在下文著重說(shuō)明的。我同時(shí)也推斷，進(jìn)樣次數(shù)很穩(wěn)定的小于100，與其說(shuō)是柱子本身的原因，還不如說(shuō)是實(shí)驗(yàn)室操作存在問(wèn)題，或者說(shuō)是某些應(yīng)用方法本身就是“柱子終結(jié)者”。

不要未處理樣品就進(jìn)樣

在我的LC課堂中，我經(jīng)常開玩笑的說(shuō)，延長(zhǎng)柱子壽命的*好方法是不要打開色譜柱的盒子。一旦你開始進(jìn)樣，就開始了柱子走向滅亡的道路。樣品有兩個(gè)主要方面可以影響色譜柱—化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)。我們把樣品中不要的化學(xué)污染物和微型顆粒**的越好，柱子的壽命就越長(zhǎng)。

使用SPE(Solide-Phase extraction)，液液萃取和其他技術(shù)來(lái)除去化學(xué)污染物是LCGC中“Sample Prep Perspectives”專欄常有這樣的文章，我就不在這里多說(shuō)了。一言以蔽之，越多的樣品前處理，越少的化學(xué)污染物進(jìn)入色譜柱，柱子壽命就越長(zhǎng)。你還得平衡一下樣品前處理費(fèi)用和它帶來(lái)的好處。

比如，你買了柱芯和試劑，并加上你投入時(shí)間的費(fèi)用，你在每個(gè)樣品上SPE的花費(fèi)會(huì)很容易超過(guò)34塊錢，這是可以承受500次進(jìn)樣量的反相柱在每個(gè)樣品分析上分?jǐn)偝杀镜?倍多，這差不多需要將色譜柱進(jìn)樣次數(shù)從500次延長(zhǎng)至2500次才扯平了。

另一方面，如果沒(méi)有做過(guò)任何處理的血漿樣品直接進(jìn)樣了，柱子可能就只能進(jìn)樣10次左右。你也要考慮到當(dāng)更多的樣品處理步驟加入的時(shí)候的數(shù)據(jù)質(zhì)量。我知道，在我們的實(shí)驗(yàn)室中，這些措施可以讓我們?cè)诘蜐舛鹊臅r(shí)候收集到有用的數(shù)據(jù)并得到一致的結(jié)果，而不是比較少的前處理步驟可能得到的結(jié)果。

不論你做沒(méi)做其他前處理步驟，幾乎所有的樣品都會(huì)從樣品過(guò)濾，離心或者兩者中得到好處。樣品經(jīng)過(guò)一個(gè)一次性的過(guò)濾膜過(guò)濾來(lái)移除可能堵住柱子進(jìn)口篩板的細(xì)顆粒物。濾膜的孔徑不能大于柱子進(jìn)口篩板的孔徑。

大部分>3μm填料顆粒的柱子用2μm孔徑的篩板，3μm填料粒徑的柱子則一般用0.5μm的篩板，填料粒徑<3-μm的柱子，比如UHPLC，一般用0.2μm的進(jìn)口篩板。*常用的樣品過(guò)濾膜是0.45μm孔徑的，這個(gè)對(duì)除了亞2μm之外的其它柱子都已經(jīng)足夠，亞2μm柱子，則需用0.2μm的濾膜。

濾膜可作為預(yù)裝在一次性注射器中的柱芯，也作為96孔板的過(guò)濾板。即使這些過(guò)濾裝置一般是有效的，但我不是非常強(qiáng)烈的推薦使用。至少有4點(diǎn)使我不同意過(guò)濾樣品。

**，樣品過(guò)濾成本比較昂貴，上一次我比較過(guò)價(jià)格，一次性購(gòu)買1000份，每份的價(jià)格都要高于3.4元，這個(gè)與柱子在每次分析中的分?jǐn)傎M(fèi)用幾乎一樣。

**，用0.5μm濾膜過(guò)濾很慢，而0.2μm濾膜則更慢。

第三，如果你在一個(gè)監(jiān)管嚴(yán)格的環(huán)境中工作，每一個(gè)樣品的處理步驟都必須一樣，這就是說(shuō)，如果你過(guò)濾了一個(gè)樣品，那么其他剩余的樣品也都要過(guò)濾，無(wú)論實(shí)際上需不需要。

*后，如果你要驗(yàn)證你的LC方法，就需要驗(yàn)證所有的過(guò)濾步驟。在過(guò)濾的過(guò)程中，樣品會(huì)有損失——如果50μL樣品經(jīng)過(guò)濾膜，得到的樣品就少于50μL。

你得證明樣品不是選擇性的損失，特別是在高濃度或者低濃度的時(shí)候。因此，我們可以看到，樣品過(guò)濾是需要花很多功夫和**的。但是你要是不怕麻煩和不要求成本，樣品過(guò)濾是在大部分的情況下都是能提高柱子的壽命的。

樣品過(guò)濾的一個(gè)替代方法（或者是補(bǔ)充）是在進(jìn)樣之前離心。這是一個(gè)簡(jiǎn)單又相對(duì)便宜的方法。只要把樣品放進(jìn)離心管，Eppendorf 離心管或者一個(gè)96孔的離心板，再放到小型臺(tái)式離心機(jī)里，調(diào)整轉(zhuǎn)速到其*大速度，旋轉(zhuǎn)5-10min。

這會(huì)使會(huì)引起篩板堵塞的顆粒沉積到樣品瓶的底部，然后把樣品轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶或板中繼續(xù)進(jìn)行分析。這種技術(shù)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中對(duì)需要沉淀蛋白質(zhì)的樣品中已經(jīng)使用了很多年，而且極少出現(xiàn)顆粒物質(zhì)相關(guān)的問(wèn)題。

我曾經(jīng)見過(guò)這樣的例子，用0.2μm的濾膜過(guò)濾之后的樣品，UHPLC進(jìn)樣，這種樣品還是有一點(diǎn)渾濁并且引起了柱子堵塞，但是這個(gè)些微渾濁的樣品離心至澄清之后，柱子堵塞的情況就會(huì)減少很多。

使用在線過(guò)濾器

我非常認(rèn)同一個(gè)在線的過(guò)濾器是LC或者UHPLC中使用成本*低的附加裝置，可以提供*大的投資回報(bào)。這種過(guò)濾器是一個(gè)非常簡(jiǎn)單的改裝管配件，其中包含了一個(gè)特定孔徑的篩板，安裝在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子（保護(hù)柱，如果用到的話）之間。

現(xiàn)在*普遍的裝置是一個(gè)直徑接近37.5px，長(zhǎng)度62.5px不銹鋼配件，其中包含一個(gè)0.5或者0.2μm孔徑的可替換的篩板。另外一種裝置是包含相同孔徑大小篩板的PEEK手緊配件。這種PEEK過(guò)濾器整體是一次性的，但是因?yàn)樗炔讳P鋼過(guò)濾器中的一次性使用的篩板要貴，使用成本會(huì)比較昂貴。

這種在線過(guò)濾器孔徑會(huì)選擇比柱子篩板孔徑小一點(diǎn)，因此它會(huì)在柱子堵塞之前先被堵塞。當(dāng)系統(tǒng)壓力開始增加的時(shí)候，你就知道在線過(guò)濾器中篩板已經(jīng)開始堵了，需要在完全堵住之前替換掉。

在線過(guò)濾器可以起到單獨(dú)的樣品過(guò)濾器一樣的功能，但在樣品前處理時(shí)，不需要額外的人力工作。如果你樣品離心了，偶爾有一些顆粒沒(méi)有過(guò)濾掉，也會(huì)被下游的在線過(guò)濾器攔截住。

在線過(guò)濾器的另一優(yōu)點(diǎn)是它能夠很便捷的更換——如果你動(dòng)手能力強(qiáng)，在5min內(nèi)你可以關(guān)掉泵、替換篩板、打開系統(tǒng)并繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

你可能想要重新進(jìn)一針系統(tǒng)適應(yīng)性樣品來(lái)檢查一下系統(tǒng)有沒(méi)有出問(wèn)題，使用在線過(guò)濾器不需要大量的調(diào)節(jié)和校準(zhǔn)，而這些在更換保護(hù)柱時(shí)都需要重新做過(guò)。在線過(guò)濾器的*后一個(gè)好處是可以過(guò)濾掉泵密封件和進(jìn)樣閥因磨損產(chǎn)生的顆粒物。我強(qiáng)烈建議在每一個(gè)LC系統(tǒng)中都安裝一個(gè)在線過(guò)濾器，即使你已經(jīng)在使用保護(hù)柱了。

保護(hù)柱

保護(hù)柱（也叫做預(yù)柱）是一種很短的裝在分析柱上游的色譜柱。這種柱子長(zhǎng)度一般為10-20mm，包含與分析柱一樣的填料，使用不大于分析柱篩板孔徑的入口篩板和出口篩板。

保護(hù)柱有雙重功能，**，入口篩板攔截可能堵塞分析柱的顆粒物，**，填料與分析柱相同，它可以捕抓住那些可能會(huì)強(qiáng)烈或者不可逆附著在分析柱填料上的物質(zhì)?？偹苤?，保護(hù)柱會(huì)延長(zhǎng)分析柱的壽命，然而，保護(hù)柱有幾個(gè)潛在的問(wèn)題。

**，他們比較貴——價(jià)格高出分析柱的40%甚至更多，考慮到增加的成本時(shí)，你柱子的壽命是否有足夠的延長(zhǎng)？

**，保護(hù)柱到底能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間？你得知道更換柱子的時(shí)間，在保護(hù)柱上的化學(xué)污染物積累太多之前，就要想辦法避免污染物進(jìn)入到分析柱中。因此，需要對(duì)進(jìn)樣次數(shù)計(jì)數(shù)或者做一個(gè)系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)來(lái)決定什么時(shí)候更換保護(hù)柱。

第三，你要判斷怎么來(lái)清洗保護(hù)柱。為了防止把污染物沖洗到分析柱中，保護(hù)柱和分析柱需要分開來(lái)清洗嗎？

*后，你可能期望將一個(gè)20mm長(zhǎng)的保護(hù)柱加裝到150mm長(zhǎng)的分析柱上，使柱效提高10%，但是這種情況很少出現(xiàn)。原因是接入一根保護(hù)柱后，系統(tǒng)管路中會(huì)增加兩個(gè)柱頭連接件和一段管路，而且保護(hù)柱沒(méi)有分析柱裝柱那么容易安裝，以上兩個(gè)方面都會(huì)降低系統(tǒng)性能。結(jié)果就是如果你運(yùn)氣好的話，你會(huì)得到一樣的理論塔板數(shù)，但常見的情況是柱效會(huì)稍有降低。

要不要用保護(hù)柱的選擇權(quán)在你。保護(hù)柱確實(shí)能延長(zhǎng)分析柱的壽命，但是我個(gè)人認(rèn)為在大多數(shù)情況下，這并不值得。

如果你選擇使用保護(hù)柱，我還是推薦在自動(dòng)進(jìn)樣器和保護(hù)柱之間連接使用一個(gè)在線過(guò)濾器。過(guò)濾器的錢只有保護(hù)柱的零頭，它還能延長(zhǎng)保護(hù)柱的使用壽命，就像它能延長(zhǎng)分析柱壽命一樣。

總結(jié)

盡管你不能讓你的分析柱壽命無(wú)限延長(zhǎng)，但還是能用一些非常簡(jiǎn)單的方法來(lái)延長(zhǎng)色譜柱這個(gè)系統(tǒng)中比較昂貴部件的壽命。

首先，按照要求對(duì)樣品進(jìn)行前處理。樣品前處理的*后一步必須是過(guò)濾或者離心。其次，使用在線過(guò)濾器來(lái)保護(hù)保護(hù)柱和分析柱，免于被樣品中或者系統(tǒng)其它部分產(chǎn)生的顆粒物堵塞。再次，如果保護(hù)柱對(duì)你的應(yīng)用有意義的話，則使用保護(hù)柱來(lái)保護(hù)分析柱。*后，在每批樣品分析之后，使用強(qiáng)溶劑來(lái)沖洗柱子，除去在柱子上的任何強(qiáng)保留物質(zhì)。

此文章主要是針對(duì)柱子污染問(wèn)題，但色譜柱壽命也取決于檢測(cè)品種的方法耐用性，如果是難度很大的項(xiàng)目， 譬如化學(xué)藥品有多個(gè)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，或中藥的指紋譜圖，往往方法耐用性 （robustness）較差，柱子壽命也會(huì)受到影響。挑選不同選擇性的色譜柱來(lái)改善分離度是提高方法耐用性的*佳選擇。